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T-cadherin肿瘤抑制基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系极其临床意义

作者：张婷娇来源：华中科技大学发布时间：2008年05月29日点击数：

（一）立项依据与研究内容

1、项目的立项依据

原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系, 其发生发展与多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。

T-cadherin分子属细胞粘附分子cadherin超家族。 Cadherin超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的Cadherin分子如E-cadherin和N-cadherin由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成，而T-cadherin因缺失经典Cadherin分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名truncated-cadherin（即T-cadherin，又称CDH13或H-cadherin）。近年来对经典的Cadherin分子的深入研究发现，E-，N-cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10）。将E-cadherin分子重新导入缺失E-cadherin分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11）。近年已开始有T-cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18），推测T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将T-cadherin基因导入缺失表达T-cadherin分子的大鼠脑胶质母细胞瘤C6细胞使其过度表达T-cadherin分子，C6细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实T-cadherin在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是T-cadherin分子通过诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究T-cadherin分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。

肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21，22，23）。T-cadherin基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致T-cadherin基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24）。T-cadherin基因位于染色体16q24，肝癌的发生与染色体16q24的缺失、突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于染色体16q24的13个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherin mRNA在HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和HA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但T-cadherin基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）进一步研究显示T-cadherin基因启动子在肝癌中高度甲基化，而E-cadherin基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在Cadherin细胞粘附分子超家族中T-cadherin基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性,且T-cadherin基因启动子甲基化与T-cadherin基因失活密切相关（26）。这些研究表明T-cadherin基因启动子甲基化是T-cadherin基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与2ug/ml去甲基化药物5-aza-2’-deoxycytidine共孵6天能使皮肤鳞癌细胞株恢复T-cadherin分子表达（17）。但目前对T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导T-cadherin分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。

本研究将进一步研究T-cadherin在肝癌中的基因功能，调查缺失表达T-cadherin的肝癌细胞株重新表达T-cadherin是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示T-cadherin基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导T-cadherin分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究T-cadherin基因与C6细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。

主要参考文献：

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2、项目的 研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题

一、研究T-cadherin在肝癌中的基因功能

1.将T-cadherin基因导入缺失表达T-cadherin的肝癌细胞株HepG2，使其表达T-cadherin分子，研究表达T-cadherin分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化，证实是否T-cadherin重新表达能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。

2.将缺失表达T-cadherin的HepG2细胞和转染后表达T-cadherin 的HepG2细胞于皮下接种裸鼠，在裸鼠肝癌模型上进一步证实T-cadherin基因的肿瘤抑制基因功能。

3．研究T-cadherin基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制。证实是否T-cadherin在肝癌细胞株存在与在C6细胞中一致的分子机制，即T-cadherin分子通过诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期G2期阻滞。

二、在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，在人肝癌中揭示T-cadherin基因失活与肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。

1.研究50例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中T-cadherin的表达，揭示T-cadherin基因表达水平（失活）与肝癌恶性分化程度、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。

2.结合临床病案记录，选择在临床分期、病理类型及治疗方法上具有可比性的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或肝外转移以及2年内未复发或肝外转移的肝癌病例的石蜡标本各20例，研究T-cadherin基因的表达，揭示T-cadherin基因表达水平（失活）与肝癌复发和转移的关系。

三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物5-aza-2’-deoxycytidine是否能重新诱导T-cadherin表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的治疗价值和可能的毒副作用。

3、拟采取的研究方案及可行性分析

一、研究T-cadherin（T-cad）在肝癌中的基因功能的技术路线

1.构建T-cad表达载体pcDNA3.T-cad

↓

以脂质体lipofectin为载体转染肝癌细胞系HepG2细胞

↓

以G418筛选表达T-cad分子的阳性克隆

↓

Western blot鉴定转染后T-cad蛋白表达

↓

比较表达T-cad的阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生物学特征:

细胞增殖计数

³H标胸腺嘧啶摄取率测定

克隆增殖试验

细胞粘附试验

细胞聚集试验

2.在裸鼠肝癌模型上观察T-cad阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生物学特征

a.裸鼠皮下分别接种10⁷ T-cadherin（+）或（-）的肝癌细胞（各20只）

b.观察：肿瘤生长速度

肿瘤转移发生的时间、累及积器官及频率

裸鼠的生存期

3.研究T-cadherin基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制

a.流式细胞仪检测表达T-cadherin阳性和阴性的肝癌细胞的细胞周期变化

b.Western blot检测细胞周期调控蛋白p53,p21,p27,cyclin D的表达变化

c.研究是否T-cadherin分子在肝癌中同样存在诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期G2期阻滞的分子机制。

二、研究T-cadherin基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系的技术路线

1.收集临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织各50例

a. 检测T-cadherin表达：定量PCR；免疫组织化学；Western blot

b.比较肝癌与癌周肝组织中T-cadherin的表达水平，研究T-cadherin缺失表达（基因失活）与人肝癌发生的关系。

c. 比较不同病例肝癌中T-cadherin的表达水平，研究T-cadherin表达水平与肿瘤病理分级、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。

2.结合临床病案记录，选择临床分期相同、病理类型一致、单个肿瘤大小在2~5cm之间、无肝内外转移、行根治性切除后采用同样的治疗方案的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或转移以及2年内未复发或转移的肝癌石蜡标本各20例

a. 检测T-cadherin表达：免疫组织化学

b. 回顾研究T-cadherin表达水平与肿瘤复发和转移的关系

三、研究去甲基化药物诱导T-cadherin表达及其治疗学意义的技术路线。

1.研究表明T-cadherin在肝癌细胞株HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和HA22TNGH中缺失。采用Herman已报导的检测T-cadherin启动子甲基化和非甲基序列的引物，进一步证实T-cadherin在上述肝癌细胞株中的启动子甲基化现象。扩增甲基化序列引物，上游5’-TCGCGGGGTTCGTTTTCGC-3’，下游5’-GACGTTTTCATTCATACGCG-3’，扩增非甲化序列引物，上游5’-TTGTGGGGTTGTTTTGT-3’，下游5’-AACTTTTCATTCATACACACA-3’。采用Western blot进一步证实T-cadherin在上述存在的启动子甲基化肝癌细胞株中蛋白水平表达缺失。

2.选择T-cadherin启动子高度甲基化的细胞株与去甲基化药物5-aza-2’-deoxycytidine（2ug/ml）作用6天后，采用Western blot检测T-cadherin蛋白水平表达; 采用细胞增殖计数、³H标胸腺嘧啶摄取率测定、克隆增殖试验、细胞粘附试验和细胞聚集试验检测T-cadherin表达前后肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化。

3.将T-cadherin启动子高度甲基化的细胞株（细胞数1x10⁷）分别接种60只裸鼠后随机分成两组（每组30只），治疗组再分成五组（每组6只），每组分别按0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug/克体重每日皮下注射5-aza-2’-deoxycytidine，共注射一周，对照组仅注射生理盐水，观察不同组裸鼠的肿瘤生长速度、肿瘤转移发生的时间、累及器官及频率及裸鼠的生存期。

4、项目的特色及创新之处

1．近年已开始有T-cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌及结直肠癌中表达显著下降、缺失的报导，推测T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色。申请人（黄志勇）最新研究首次证实T-cadherin在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并首次揭示其肿瘤抑制功能的分子机制（Huang Zhiyong等，Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578）。但目前尚无人对T-cadherin在肝癌中的基因功能及其分子机制进行研究。基于申请人前期世界领先的研究工作基础，该研究将进一步揭示T-cadherin分子在肝癌中的基因功能和其分子机制，具有世界先进性和独创性。

2. Cadherin分子，如E-，N-cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤的发生及转移特征密切相关，但目前对T-cadherin基因失活与肝癌的侵犯及转移等生物学特征的关系目前尚无研究，该研究具有先进性和独创性。

3.T-cadherin基因启动子甲基化在肝癌中具有特异性,且 T-cadherin基因启动子甲基化与T-cadherin基因失活密切相关。但对应用去甲基化药物诱导T-cadherin表达并研究其对肝癌的治疗学意义目前尚无研究。该研究具有创新性和实用性。

4.该研究的独到之处在于揭示最新肿瘤抑制基因T-cadherin基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系以及去甲基化药物对肝癌的治疗作用，该研究对进一步揭示肝癌发生发展的分子机制、研究更有效的治疗药物具有重要的科学及临床意义。

5、年度研究计划及预期研究成果

研究计划及进度：

2005.1-2005.12 在肝癌细胞株和裸鼠肝癌模型上研究T-cadherin在肝癌中的基因功能。证实是否T-cadherin抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。揭示T-cadherin基因表达抑制肝癌细胞恶性生物学特征的分子机制。

2006.1-2006.12 在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，揭示T-cadherin的肿瘤抑制基因功能失活与临床肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。

2007.1-2007.12在肝癌细胞株和裸鼠种植肝癌模型上研究去甲基化药物是否能重新诱导T-cadherin表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的潜在的治疗价值治疗作用和可能的毒副作用。

预期研究成果：

1.在国际上有影响的刊物发表论文3-4篇，在国内权威期刊上发表论文8-10篇。

2.预期科研成果3项：

a.T-cadherin基因在肝癌中的基因功能及其机制

b.T-cadherin基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系

c.利用去甲基化试剂诱导T-cadherin表达对肝癌的治疗学价值

（二）研究基础与工作条件

1、工作基础：

申请人从事肿瘤发生的分子机制，肝癌的免疫及基因治疗研究多年，发表研究论文19篇，其中6篇被SCI收录，影响因子多达40。在美国华盛顿大学神经肿瘤及分子遗传研究室从事神经系统肿瘤发生的分子机制的研究工作近4年，主要从事脑胶质细胞瘤发生、发展的分子机制，利用基因芯片寻找与脑胶质细胞瘤发生发展相关的遗传改变，并利用已知的脑胶质细胞瘤的遗传改变，如Ras激活突变， NF1基因缺失，cdk4过表达，P53及Rb缺失，并在动物模型上进一步验证上述遗传改变与脑胶质细胞瘤发生发展的关系。首次利用GFAP启动子成功地建立了脑胶质细胞特异性CDK4基因过表达的动物模型，并揭示了CDK4过表达与P53基因缺失对脑胶质细胞增殖的协同作用。该文发表于Oncogene 2002, 21:1325-1334（影响因子 6.0）。该CDK₄转基因鼠系正在申请美国专利。同时，探索研究新基因如T-cadherin和GAP43基因对脑胶质细胞瘤生长、转移等恶性生物学特征的关系，首次发现T-cadherin和GAP43是两个重要的参与脑胶质细胞瘤生长调控的基因，并揭示其调节机制。论文分别发表于 Molecular and Cellular Biology 2003, 23:566-578（影响因子 8.8）和Cancer Research 2003, 63:2933-2939（影响因子 8.3）。参加在美国和印度召开的国际会议3次，在研究基因功能与肿瘤恶性生物学特征的关系、肿瘤发生的分子机制及治疗研究领域积累了丰富的经验。

在对T-cadherin基因的研究中，首次证明了细胞粘附分子T-cadherin是抑制脑胶质细胞瘤生长及转移等恶性生物学特征的重要肿瘤抑制基因，并揭示其分子机制是T-cadherin分子通过诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578。这一研究发现为进一步研究T-cadherin分子在肝癌中的作用、功能及临床意义奠定了坚实的基础。

2 \前期关于T-cadherin研究的基础工作：

图1. 胶质母细胞瘤C6细胞转染T-cadherin基因后细胞增殖受抑。

A.Western blot显示转染T-cadherin基因后成熟型（105kDa）和前体（130kDa）T-cadherin分子在C6细胞中的表达。而转染空载体pcDNA3的C6细胞不表达T-cadherin。

B.以同样摩尔数的pcDNA3.T-cadherin和pcDNA3转染C6细胞后14天，前者培养皿中形成的细胞克隆数显著低于后者。

C.克隆计数显示二者有极显著统计学差异（P<0.01）。